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本试剂盒是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的cDNA第一链合成试剂盒。本制品包含从RNA模板逆转录成cDNA第一链所需的所有试剂，其中包括MMLV逆转录酶、反应缓冲液、引物、dNTP等。经过突变改造的MMLV逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解，更容易获得全长的cDNA。MMLV逆转录酶热稳定性强，可得高产量的cDNA，使用简单方便。本系统对后续的PCR以及定量PCR试验兼容性高，适用各种PCR反应的DNA聚合酶。

• RNase H^-：经突变的MMLV逆转录酶，RNase H活性缺失，更易获得全长cDNA。
  
• 使用方便：试剂盒包含除RNA模板外的逆转录所需全部试剂。

• 在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
  
• 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
  
• 本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
  
• 若起始RNA的量小于50ng，建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。

• 将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、MMLV和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  
• 根据以下表格配制反应体系，总体积为20μL。
  

  成分	用量	终浓度
  dNTP Mix(2.5mM Each)	4μL	500μM Each
  Primer Mix	2μL
  RNA Template	Xμl	1ng～5μg
  5×RT Buffer	4μL	1×
  100mM DTT	2μL	10mM
  MMLV(200U/μL)	1μL
  RNase-Free Water	up to 20μL

  
  注意：Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
  
• 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
  
• 42℃孵育30～50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
  
• 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

• 将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、MMLV和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  
• 根据以下表格配制反应体系，总体积为13μL。
  

  成分	用量	终浓度
  dNTP Mix(2.5mM Each)	4μL	500μM Each
  Primer Mix	2μL
  RNA Template	XμL	1ng～5μg
  RNase-Free Water	至13μL

  
  
• 70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
  
• 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
  
• 继续向以上反应液中加入以下试剂：
  

  成分	用量	终浓度
  5×RT Buffer	4μL	1×
  100mM DTT	2μL	10mM
  MMLV(200U/μL)	1μL

  
  注意：primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成。
  
• 轻轻吹打混匀，42℃孵育50分钟，85℃孵育5分钟。
  
• 反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
  
• 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。